X-Gal的使用方法
首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100 ml的瓊脂培養基中,加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培養基。當DNA片段插入至pUC系列載體(或其他帶有lacZ、Amp基因載體),然后轉化至lacZ缺失細胞中后,涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培養基,可根據長出菌體的藍白色,而方便地挑選出基因重組 體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。
IPTG-X-gal 平板制備的過程
一、IPTG儲液配置:一般將IPTG配成20%(m/V)(約0.84M)的母液。稱取0.5克 IPTG粉末,用2 ml蒸餾水將其*溶解后,補加蒸餾水至2.5ml,用孔徑0.22 μm的小型注射型過濾器 (預先裝好濾膜滅菌備用)過濾除菌,-20 ℃凍存。
二、X-gal儲液配置:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。稱取0.2克X-gal,加入10ml二甲基甲酰胺(DMF),溶解后保存于一小血清瓶內,裝有X-gal溶液的血清瓶須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞,并應貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。
三、IPTG-X-gal平板制備:在含氨芐或卡那抗生素平板上,滴加40 µL的X-gal儲液及5 µL的IPTG儲液(怕體積過小影響涂布均勻,可適當稀釋后再涂布),涂布均勻后晾干后使用。在臨使用前提前1h制備。
為方便實驗操作,試驗中也可以將X-gal和IPTG的儲備液按照菌液體積和平板數量計算好濃度,直接加入到準備用于涂平板的細菌培養液中,混勻后即可涂平板,這樣可以節省試驗時間。若經過培養后長出的菌落藍白斑顯示的不夠明顯,可以將平板放入4度冰箱里,過一段時間以后菌落的藍白斑就顯示的比較清晰了。
X-Gal的注意事項:
培養噬菌體時,Top agar中的添加量為:50 μl/3 ml(20mg/ml)。含有X-Gal的培養基4℃避光保存,須在1~2周內使用。